【聚合氯化鋁】
在污水處理中，由于硝化細(xì)菌是自養(yǎng)異養(yǎng)細(xì)菌且生長(zhǎng)緩慢，容易流失，所以近年來固定化微生物技術(shù)的應(yīng)用越來越受到人們的關(guān)注.固定化微生物技術(shù)是通過化學(xué)或物理的手段, 將微生物細(xì)菌限定于載體空間區(qū)域內(nèi)，保持其活性并且可以反復(fù)利用.與傳統(tǒng)生物處理法相比，固定化微生物技術(shù)具有微生物流失少、污泥產(chǎn)量少、抗沖擊負(fù)荷能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以包埋預(yù)先篩選出的特種菌種，運(yùn)用于污水處理系統(tǒng)中.目前，包埋固定化硝化細(xì)菌處理氨氮廢水成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究焦點(diǎn).郝婧所用的包埋固定化硝化細(xì)菌處理高氨氮廢水，在反應(yīng)溫度為28~30℃，pH為8.2，包埋顆粒體積填充率為25%的條件下，氨氧化速率*高約30 mg·(L·h)-1.利用固定化氨氧化細(xì)菌進(jìn)行含氮廢水短程硝化時(shí)發(fā)現(xiàn)，溫度為30℃，pH為8.5時(shí)亞硝酸鹽氮積累率可達(dá)90%以上，氨氧化速率*高約為7.9 mg·(L·h)-1.Inoue等以聚乙烯醇為載體固定硝化細(xì)菌，填充率為50%時(shí)處理低溫氨氮廢水，硝化速率為17 mg·(L·h)-1.由此可見包埋硝化細(xì)菌處理氨氮廢水反應(yīng)效率通常較低，且包埋后需嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，達(dá)到亞硝酸鹽氮的高積累.
因此，包埋硝化細(xì)菌實(shí)現(xiàn)短程硝化是可行的.但硝化細(xì)菌中氨氧化細(xì)菌含量較少，嚴(yán)重影響了硝化速率.為此，本實(shí)驗(yàn)研究氨氧化細(xì)菌的包埋固定化.以水廠回流污泥為菌源，定向篩選AOB并淘汰NOB，以期達(dá)到細(xì)菌包埋完成后能實(shí)現(xiàn)較高的氨氧化速率和亞硝酸鹽氮積累率.
1 材料與方法1.1 污泥來源與實(shí)驗(yàn)裝置
實(shí)驗(yàn)污泥取自北京高碑店處理廠硝化污泥.污泥富集培養(yǎng)連續(xù)流裝置見圖 1，反應(yīng)池有效容積22 L.
圖 1 污泥富集培養(yǎng)裝置示意
污泥富集培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)采用人工模擬氨氮廢水，主要成分有: NH4Cl(投加量取決于NH4+-N濃度)，Na2CO3(投加量取決于NH4+-N濃度)，K2HPO4、KH2PO4(投加量取決于NH4+-N濃度，其中N:P為5)，MgSO4·7H2O(20mg·L-1)，CaCl2·2H2O(10mg·L-1).每升進(jìn)水中加入0.5 mL微量元素，其中ZnSO4·7H2O(0.12 mg·L-1)，NaMoO4·2H2O(0.12mg·L-1)，CoCl2·6H2O(0.15mg·L-1)，MnSO4·H2O(0.12mg·L-1)，NiCl2·6H2O(0.120 mg·L-1)，CuSO4·5H2O(0.03mg·L-1)和FeCl3·6H2O(1.5 mg·L-1).
培養(yǎng)過程中反應(yīng)溫度控制在25℃，DO為1~1.5 mg·L-1范圍內(nèi)，pH為8~8.4.實(shí)驗(yàn)起始時(shí)MLSS為4 030 mg·L-1，MLVSS為2 473 mg·L-1，實(shí)驗(yàn)過程中每天連續(xù)排泥.初期進(jìn)水氨氮濃度為100 mg·L-1，后逐步提高至700 mg·L-1.水力停留時(shí)間由4 h縮短到2 h.
1.2 包埋填料的制備與應(yīng)用
按照本實(shí)驗(yàn)室成熟的包埋技術(shù)，取7 L富集培養(yǎng)后的污泥進(jìn)行離心濃縮，加入膠狀體聚乙烯醇(PVA)混合制成包埋液，均勻涂裝在條狀載體上，包埋液中PVA與濃縮污泥的濃度分別為10%和25%.以硼酸和無水硫酸鈉為交聯(lián)劑交聯(lián)4 h.包埋連續(xù)流裝置同上，包埋填料填充率為8%.實(shí)驗(yàn)采用人工模擬氨氮廢水，其構(gòu)成同上.實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行，反應(yīng)pH為7.2~8，DO為2~4 mg·L-1之間.實(shí)驗(yàn)進(jìn)水氨氮濃度由50 mg·L-1逐步提高至250 mg·L-1，HRT為4 h.為適應(yīng)高碑店污水處理廠的實(shí)際進(jìn)水氨氮濃度，在氨氧化速率和亞硝酸鹽氮積累率穩(wěn)定后，降低進(jìn)水氨氮濃度至30~40 mg·L-1，并縮短水力停留時(shí)間至2 h.
1.3 實(shí)驗(yàn)分析方法1.3.1 高通量測(cè)序分析方法
取原始污泥混合液和富集培養(yǎng)后的污泥混合液分別標(biāo)記為Yu01和Yu02，提取DNA并對(duì)樣本16S rRNA的V3-V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增.
采用Illumina HiSeq2500 PE250高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)序.針對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行環(huán)境微生物的16S分析，首先對(duì)原始的paired-end reads進(jìn)行過濾得到高質(zhì)量reads，然后通過序列拼接得到較長(zhǎng)的序列，將其與16S參考數(shù)據(jù)庫(kù)作比對(duì)，同時(shí)去除嵌合體序列，*終將過濾后的序列按照一定的閾值進(jìn)行歸類，得到多個(gè)序列聚類操作分類單元(OTUs)，設(shè)定閾值的序列相似性為0.97分為同一類，分成的一個(gè)類就是一個(gè)OTU，代表一個(gè)種.接著根據(jù)OTUs結(jié)果進(jìn)行α多樣性的計(jì)算. α多樣性指標(biāo)包括豐富度指數(shù)(ACE)、多樣性指數(shù)(Shannon、Simpson)、goods_coverage和observed_species等.其中豐富度衡量單個(gè)樣本中物種種類個(gè)數(shù)，實(shí)際通過估算OTU的個(gè)數(shù)來衡量;多樣性指數(shù)衡量群落的異質(zhì)性. goods_coverage表示樣品文庫(kù)的覆蓋率，即測(cè)序深度指數(shù)，其數(shù)值越高，則樣本中序列沒有被測(cè)出的概率越低. Observed_species代表該樣品中OTU的個(gè)數(shù).
1.3.2 其他分析方法
NH4+-N采用納氏試劑分光光度法測(cè)定;NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法測(cè)定;NO3--N采用紫外分光光度法測(cè)定;pH采用SX711便攜式pH計(jì)測(cè)定;溶解氧采用JPSJ-605F型溶解氧儀測(cè)定.
2 結(jié)果與討論2.1 氨氧化細(xì)菌富集培養(yǎng)階段結(jié)果及分析2.1.1 進(jìn)水氨氮濃度與污泥比氨氧化速率變化情況分析
從圖 2可以看出，反應(yīng)起始階段(1~5 d)進(jìn)水氨氮控制在100 mg·L-1，HRT為4 h，污泥比氨氧化速率開始由0.103 g·(g·d)-1緩慢增長(zhǎng)至0.348 g·(g·d)-1.此時(shí)還處于活性恢復(fù)階段，為了提高污泥比氨氧化速率，從第6 d開始提高進(jìn)水氨氮濃度并將HRT縮短為3 h.至第22 d，由于污泥比氨氧化速率增長(zhǎng)較快，提高進(jìn)水氨氮濃度至400 mg·L-1并同時(shí)縮短HRT至2 h并保持不變.
圖 2 污泥進(jìn)水氨氮濃度及污泥比氨氧化速率變化
經(jīng)過30 d的富集培養(yǎng)，污泥比氨氧化速率呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)至1.368 g·(g·d)-1.隨著污泥比氨氧化速率的不斷提高，在水力停留時(shí)間2 h內(nèi)出水氨氮濃度逐漸減小為零，此時(shí)反應(yīng)較易向全程硝化轉(zhuǎn)化.所以繼續(xù)增加進(jìn)水氨氮濃度至500 mg·L-1，此時(shí)污泥比氨氧化速率增長(zhǎng)緩慢，說明高濃度氨氮對(duì)氨氧化細(xì)菌的活性有一定抑制作用.而后繼續(xù)增加進(jìn)水氨氮濃度至700 mg·L-1，可以發(fā)現(xiàn)在短暫的適應(yīng)期過后，污泥比氨氧化速率繼續(xù)增長(zhǎng)，*終高達(dá)2.028 g·(g·d)-1.污泥比氨氧化速率的持續(xù)增長(zhǎng)可以證明富集培養(yǎng)階段氨氧化細(xì)菌活性不斷增強(qiáng).
2.1.2 污泥濃度變化情況分析
由于反應(yīng)體系中始終保持著較高濃度的亞硝酸鹽氮，作為NOB的反應(yīng)底物，亞硝酸鹽氮的積累對(duì)NOB的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用.為了將NOB徹底淘洗出去，實(shí)驗(yàn)過程中每天不斷排泥.從圖 3可以看出，前23 d系統(tǒng)中MLVSS不斷增長(zhǎng)，這是由于前期排泥量較小.為保持系統(tǒng)中穩(wěn)定的污泥濃度，第24 d開始加大排泥量，污泥濃度逐漸減小，至第35 d基本穩(wěn)定.盡管每天不間斷排泥，系統(tǒng)總污泥濃度仍不間斷增長(zhǎng)，后由高通量測(cè)序可知污泥中氨氧化細(xì)菌大量增長(zhǎng).
圖 3 污泥濃度變化
2.1.3 污泥亞硝酸鹽氮積累率變化情況分析
從圖 4可以看出，反應(yīng)起始階段(1~5 d)亞硝酸鹽氮積累率由33%迅速增長(zhǎng)至70%.從第6 d開始提高進(jìn)水氨氮濃度后，亞硝酸鹽氮積累率進(jìn)一步增加至85%以上并逐漸穩(wěn)定.此后由于氨氮濃度不斷提高，F(xiàn)A對(duì)NOB的抑制作用不斷增大，且每天不間斷地排泥，致使NOB活性越來越低且數(shù)量越來越少.而此時(shí)氨氧化細(xì)菌大量增長(zhǎng)且活性不斷增強(qiáng)，在系統(tǒng)中占有明顯的生態(tài)優(yōu)勢(shì).這使得亞硝酸鹽氮積累率從第20 d起始終保持在90%以上.
圖 4 污泥亞氮積累率變化
本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第60 d，污泥比氨氧化速率的高表達(dá)和亞硝酸鹽氮的高積累已達(dá)到預(yù)期效果，此時(shí)取污泥樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)果表明氨氧化細(xì)菌已成為優(yōu)勢(shì)菌種，可以進(jìn)行后續(xù)包埋實(shí)驗(yàn).另外，本實(shí)驗(yàn)污泥富集培養(yǎng)階段出水用于反硝化實(shí)驗(yàn)，脫氮后排放.
2.1.4 污泥多樣性及菌群變化分析
通過對(duì)兩組樣品16S rRNA基因文庫(kù)高通量測(cè)序，污泥原樣(Yu01) 與富集培養(yǎng)后的污泥樣品(Yu02) α多樣性指標(biāo)計(jì)算結(jié)果見表 1.
表 1 α多樣性指標(biāo)計(jì)算結(jié)果
由表 1可知，兩個(gè)樣品的文庫(kù)覆蓋率均大于0.98，表明測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣本中所有的物種. Yu01的Shannon多樣性指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)大于Yu02，說明原污泥群落多樣性高于篩選后的污泥.多樣性指數(shù)較高的原始污泥群落各種之間個(gè)體分配較均勻，而篩選后的污泥各種之間生物量差異較大，優(yōu)勢(shì)種群明顯.
為了更深入研究系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)菌種，計(jì)算每個(gè)樣本在屬級(jí)的相對(duì)豐富度. 表 2、表 3列出了每個(gè)樣品前三類優(yōu)勢(shì)菌屬及與硝化作用相關(guān)的Nitrospira和Nitrosomonas所占百分比及系統(tǒng)分類.
表 2 Yu01優(yōu)勢(shì)菌屬
表 3 Yu02優(yōu)勢(shì)菌屬
與常規(guī)分子生物學(xué)手段相比，高通量測(cè)序可以提供更豐富的微生物信息.盡管如此，Yu01與Yu02仍有50.5%與51.4%的序列無法歸入已知細(xì)菌屬.原泥樣品菌群分布較均勻，均為廢水處理系統(tǒng)中的常見菌種.其中與硝化作用相關(guān)的為Nitrospira和Nitrosomonas.已知的Nitrospira菌屬為硝酸鹽氧化細(xì)菌，Nitrosomonas菌屬為氨氧化細(xì)菌，前者為后者的11.25倍.篩選后的污泥樣品中，Nitrosomonas成為優(yōu)勢(shì)菌，這與Wells等的研究結(jié)果一致，即絕大多數(shù)反應(yīng)器中Nitrosomonas是AOB的優(yōu)勢(shì)菌種.而Nitrospira僅占系統(tǒng)的0.02%，此時(shí)Nitrosomonas是Nitrospira的900倍.
2.2 包埋氨氧化細(xì)菌短程硝化階段結(jié)果及分析2.2.1 包埋填料短程硝化效率與亞氮積累率變化情況
對(duì)包埋填料進(jìn)行活性恢復(fù).由圖 5可知起始階段系統(tǒng)進(jìn)水氨氮濃度為50 mg·L-1，氨氧化速率由1 mg·(L·h)-1緩慢增加至6 mg·(L·h)-1.此時(shí)氨氧化速率較低，從第12 d起為提高反應(yīng)速率將進(jìn)水氨氮濃度增加至100 mg·L-1，可以發(fā)現(xiàn)隨著氨氮濃度的增加，氨氧化速率增長(zhǎng)加快，至第19 d迅速增長(zhǎng)至20 mg·(L·h)-1.因此，通過逐步增加進(jìn)水氨氮濃度的方法提高氨氧化速率是可行的.此后繼續(xù)階段性地提高進(jìn)水氨氮濃度至250 mg·L-1，氨氧化速率*可高達(dá)50 mg·(L·h)-1.
圖 5 包埋填料氨氧化速率變化
從圖 6可以看出，實(shí)驗(yàn)過程中系統(tǒng)始終保持95%以上亞硝酸鹽氮積累率.證明系統(tǒng)中氨氧化細(xì)菌始終保持著**的生態(tài)優(yōu)勢(shì).由此可以證明，包埋固定本實(shí)驗(yàn)篩選后的氨氧化細(xì)菌有利于實(shí)現(xiàn)硝化系統(tǒng)中穩(wěn)定的亞硝酸鹽氮積累.
圖 6 包埋填料亞氮積累率變化曲線
2.2.2 模擬水廠進(jìn)水氨氮濃度下的處理效果
為適應(yīng)高碑店污水處理廠的實(shí)際進(jìn)水氨氮濃度，在氨氧化速率和亞硝酸鹽氮積累率穩(wěn)定后，降低進(jìn)水氨氮濃度至30~40 mg·L-1.由圖 7、8可以看出，系統(tǒng)始終保持著90%以上的氨氮去除率以及亞硝酸鹽氮積累率.
圖 7 系統(tǒng)氨氮去除率變化
圖 8 系統(tǒng)亞氮積累率變化
3 結(jié)論
(1) 采用連續(xù)流運(yùn)行方式逐步提高進(jìn)水氨氮濃度，可以促進(jìn)氨氧化細(xì)菌活性的增強(qiáng)并使之大量增長(zhǎng)，從而大大地提高氨氧化速率，但高濃度氨氮對(duì)氨氧化細(xì)菌的活性有一定的抑制作用.具體參見資料或更多相關(guān)技術(shù)文檔。
(2) 固定化富集培養(yǎng)后的氨氧化細(xì)菌，反應(yīng)器包埋填充率為8%時(shí)，氨氧化速率*高可達(dá)50 mg·(L·h)-1，亞硝酸鹽氮積累率穩(wěn)定在90%以上.
(3) 用包埋填料處理水廠模擬污水，氨氮去除率和亞硝酸鹽氮積累率均可保持在90%以上.
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